DETERMINACIÓN
DE LA CONCENTRACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR
RESUMEN
Se determinó la concentración y viabilidad de una suspensión celular (linfoma de células B). El azul tripán tiñe a las células que presentan daño en la membrana plasmática, fue utilizado para diferenciar entre células viables y no viables / teñidas con azul tripán. Se preparó una disolución 1:2 con 10 μL del cultivo y azul de tripàn. Se usó la cámara de Neubauer para contar e inferir el número de células viables, como concentración celular, expresadas en células por mililitro. El volumen celular en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados contados. Se encontró a partir de las células (linfoma de células B) proporcionadas un 85.92 % de viabilidad y 580 0000 cel /mL de concentración celular.
INTRODUCCIÓN
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión, así como el porcentaje de éstas que son viables. Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, una de ellas es la cámara de contaje celular de la que existe numerosas variantes, entre ellas la cámara de Neubauer hasta equipos automáticos de contaje celular como el "Cell Coulter" de la empresa Beckman-Coulter.
La cámara de Neubauer o hemacitómetro (Figura 1), es utilizada generalmente para la cuenta de células sanguíneas como son los eritrocitos (glóbulos rojos) y linfocitos (glóbulos blancos), pero también puede ser utilizada para el conteo de otros tipos celulares. Las áreas grandes indicadas con los números 1, 2, 3 y 4 en la Figura 1 son utilizadas para contar los glóbulos blancos y el área con el número 5 es para contar los glóbulos rojos y plaquetas. Está cámara de contaje se adaptada al microscopio óptico. La cámara consta de un cubre objetos de cuarzo, con una depresión en el centro, y con una cuadricula marcada. Y con portaobjetos de un grosor mayor a los de uso común. En la parte superior del porta objetos se encuentran cuatro canales longitudinales y uno trasversal central. En la parte superior e inferior del canal trasversal están grabadas dos rejillas, las cuales están a su vez subdivididas.
El volumen celular en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados contados.1
Para determinar la viabilidad celular se emplean el método de tinción con azul tripán. El azul tripán es un colorante vital que se introduce en el interior de las células que presentan ruptura o daño en la membrana plasmática. Las células que aparecen en el microscopio, de color azul, son consideradas no viables.
Linfoma de células B .Grupo heterogéneo de tumores linfoides que generalmente expresan uno o más antígenos de células B o que representan la transformación maligna de linfocitos B del sistema inmunitario.2
Se determinó la concentración y viabilidad de una suspensión celular (linfoma de células B). El azul tripán tiñe a las células que presentan daño en la membrana plasmática, fue utilizado para diferenciar entre células viables y no viables / teñidas con azul tripán. Se preparó una disolución 1:2 con 10 μL del cultivo y azul de tripàn. Se usó la cámara de Neubauer para contar e inferir el número de células viables, como concentración celular, expresadas en células por mililitro. El volumen celular en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados contados. Se encontró a partir de las células (linfoma de células B) proporcionadas un 85.92 % de viabilidad y 580 0000 cel /mL de concentración celular.
INTRODUCCIÓN
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión, así como el porcentaje de éstas que son viables. Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, una de ellas es la cámara de contaje celular de la que existe numerosas variantes, entre ellas la cámara de Neubauer hasta equipos automáticos de contaje celular como el "Cell Coulter" de la empresa Beckman-Coulter.
La cámara de Neubauer o hemacitómetro (Figura 1), es utilizada generalmente para la cuenta de células sanguíneas como son los eritrocitos (glóbulos rojos) y linfocitos (glóbulos blancos), pero también puede ser utilizada para el conteo de otros tipos celulares. Las áreas grandes indicadas con los números 1, 2, 3 y 4 en la Figura 1 son utilizadas para contar los glóbulos blancos y el área con el número 5 es para contar los glóbulos rojos y plaquetas. Está cámara de contaje se adaptada al microscopio óptico. La cámara consta de un cubre objetos de cuarzo, con una depresión en el centro, y con una cuadricula marcada. Y con portaobjetos de un grosor mayor a los de uso común. En la parte superior del porta objetos se encuentran cuatro canales longitudinales y uno trasversal central. En la parte superior e inferior del canal trasversal están grabadas dos rejillas, las cuales están a su vez subdivididas.
El volumen celular en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados contados.1
Para determinar la viabilidad celular se emplean el método de tinción con azul tripán. El azul tripán es un colorante vital que se introduce en el interior de las células que presentan ruptura o daño en la membrana plasmática. Las células que aparecen en el microscopio, de color azul, son consideradas no viables.
Linfoma de células B .Grupo heterogéneo de tumores linfoides que generalmente expresan uno o más antígenos de células B o que representan la transformación maligna de linfocitos B del sistema inmunitario.2
MATERERIALES Y MÉTODOS
Equipo: Micropipeta de 100μL (Clinipett autoclavablel), micropipeta de 10μL, Cámara de Neubauer Bright light hemacytomether (Hausser scientific), Microscopio óptico (Leica).
Material: Puntas estériles para micropipeta (azul y amarilla), Tubos Eppendorf de 1.5 mL., Azul de Tripán (sigma T8154).
Procedimiento:
Preparación de la disolución 1:2. Se tomó 100µL del cultivo celular (linfoma de células B) y se colocó en un Eppendor. En otro Eppendor se agregó 10µL de azul tripán. Se homogenizó el cultivo con una micropipeta, y a partir del él se tomó 10µL, que fueron agregados al Eppendor en donde estaba contenido el azul tripán. Se prosiguió a homogenizar la mezcla azul tripán y cultivo nuevamente. Obteniendo así una dilución 1:2 del cultivo celular (factor dilución).
Montaje en la cámara de Neubauer. En la cámara de Neubauer se colocó el cubre objetos a lo largo. Con la punta de la micropipeta dispuesta en el canal, 10 μL de la suspensión de células y colorante se dejaron fluir por debajo del cubreobjetos en la cámara hasta que el área de la cuadrícula se llenó, evitando que se derramará o que entraran burbujas en el área de conteo. Figura 2.
Observación y conteo al microscopio. Una vez preparada la cámara Neubauer se colocó sobre la platina del microscopio óptico, dejándola unos minutos en reposo para que se sedimenten las células, sin dejar secar. Se observó y contó con el objetivo 10x en los cuadrantes 1, 2, 3, y 4. Una vez terminado el conteo se limpió la cámara de Neubauer.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
El conteo de las células observadas en los cuadrantes 1, 2, 3 y 4 de la
cámara de Neubauer se registró en la Tabla 1. Se observó células teñidas de
azul / no viables (19) y células brillantes/ viables (116), de un total de 135
células contadas. En la figura 3 se observan las células (brillantes /viables y
teñidas de azul/ no viables) en el cuadrante tres de la cámara de Neubauer. Se
realizaron cálculos para determinar % de viabilidad y concentración celular de
la muestra proporcionada (linfoma de células B), cuyo valor obtenido fue 85.92%
y 580 0000 cel /mL, respectivamente.
DISCUSIONES
Factores como la homogenización de y /o de la muestra o azul tripán, re suspensión de la muestra, exactitud y presión de los volúmenes tomados por las micropipetas, y la destreza de la persona para contar las células pueden afectan los resultados, por lo que son muy importantes estos aspectos, para obtener resultados confiables. Se consideró que los factores anteriores fueron controlados adecuadamente dentro de lo posible (calibración dudosa de las micropipetas) pero lo resultados están dentro de un rango aceptable.
CONCLUSIONES
Mediante la tinción con azul tripán, fue posible la diferenciación entre
células viables/ brillantes y teñidas de azul / no viables, y así determinar el
porcentaje de viabilidad celular. Con la cámara de Neubauer fue posible inferir
la concentración celular. Se encontró a partir de las células (linfoma de
células B) proporcionadas un 85.92 % de viabilidad y 580 0000 cel /mL de
concentración celular.
BIBLIOGRAFÍA
1. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. Gonzales de Buitrago J. 2004 Segunda edición. Ediciones Masson. Barcelona, España. Parte III, pag.278-279
2. Anatomía patológica. Steves A, Lowe J. 2001 segunda edición al español. Ediciones Harcourt, Madrid España. Capitulo 15, enfermedades de los ganglios linfáticos, Pag 310-311.
BIBLIOGRAFÍA
1. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. Gonzales de Buitrago J. 2004 Segunda edición. Ediciones Masson. Barcelona, España. Parte III, pag.278-279
2. Anatomía patológica. Steves A, Lowe J. 2001 segunda edición al español. Ediciones Harcourt, Madrid España. Capitulo 15, enfermedades de los ganglios linfáticos, Pag 310-311.
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