Técnicas de aplicación del Azul Brillante

El empleo de colorantes vitales (es decir, de tinciones capaces de modificar el color de los tejidos vivos produciendo un daño mínimo a sus células) en la cirugía vitreorretiniana se ha denominado cromovitrectomía. La utilidad de los colorantes vitales (CV) radica en su capacidad específica de teñir diferentes estructuras como las células o las fibras de colágeno. Los CV se han utilizado en el campo de la Oftalmología además de la cirugía vítreorretiniana, en otros campos como la cirugía de la córnea, conjuntiva, glaucoma, cataratas, estrabismo, órbita y vías lagrimales.



La principal indicación de la cromovitrectomía es la tinción de las estructuras transparentes de la interfase vitreorretiniana. La primera mención de este procedimiento se remonta a finales de los años 70 cuando Abrams mencionó la aplicación de la fluoresceína sódica en la identificación del vítreo. Desde aquel momento, no se volvió a hablar de estos procedimientos hasta el inicio del presente siglo, cuando se consideró que una mejor definición del tejido podría reducir el trauma tisular asociado (en especial sobre la capa de fibras nerviosas de la retina) tras los primeros resultados publicados por Eckardt en el pelado de la membrana limitante interna (MLI) para el tratamiento del agujero macular. A partir de este momento, la tasa de éxito en el cierre de los agujeros maculares alcanzó hasta un 96% de los casos, frente al 58 a 95% previo descrito por algunos autores. Para lograr este objetivo se utilizaron colorantes de uso intravenoso en Oftalmología (fluoresceína y verde indocianina, ICG), y se aprovecharon las propiedades de la triamcinolona para la tinción del vítreo (ya observadas tras su inyección por Peyman y posteriormente aplicadas por Burk para la tinción del vítreo prolapsado a la cámara anterior).



El pelado quirúrgico de la MLI puede lesionar la capa de fibras nerviosas (con el consiguiente defecto de campo visual descrito hasta en un 50% de los casos), y dañar el epitelio pigmentario de la retina (EPR). Los defectos campimétricos postquirúrgicos se han relacionado con el trauma quirúrgico a la papila, con el intercambio líquido-gas (por la deshidratación del tejido), con la elevación de la presión intraocular postoperatoria y con el traumatismo directo de la retina. Tanto el trauma quirúrgico como la fototoxicidad pueden producir una lesión del EPR que se manifiesta en forma de hiperpigmentación o hipofluorescencia en la AFG.



TÉCNICA DE APLICACIÓN DEL COLORANTE DURANTE LA VITRECTOMÍA



Se han descrito diferentes técnicas de tinción en la cavidad vítrea con colorantes vitales. Una de estas formas es la denominada «técnica seca» que se realiza con el ojo lleno de aire, tras la eliminación del líquido de la cavidad vítrea seguida de un intercambio líquido gas antes de la inyección del colorante. Este procedimiento plantea la ventaja de una mayor concentración de colorante sobre la retina y de evitar el contacto del mismo con el cristalino, a expensas de inducir una posible toxicidad retiniana debido a su elevada concentración.



El segundo procedimiento es el «método húmedo» que se lleva a cabo con el ojo lleno de líquido (por lo general de una solución salina balanceada) mientras se inyecta el colorante sobre la superficie de la retina. En estos casos la concentración del colorante es menor al estar diluido en el fluido de la cavidad vítrea, con el inconveniente de que el colorante se puede dispersar y teñir otras zonas de la retina o los cristaloides posteriores. Czajka y cols. Compararon ambos procedimientos en un modelo de ojos de cerdo y hallaron que el primer procedimiento se asociaba a una mayor incidencia de atrofia del EPR y degeneración de la retina externa.



Harbin y Chu han desarrollado un sistema de aplicación del colorante, el VINCE (Vitreoretinal INternal limiting membrane Color Enhancer; Dutch Ophthalmic, Zuidland, Países Bajos), que consiste en un pincel formado por una cánula de reflujo modificada de 20 G que contiene un tubo de silicona rodeado por una cánula de metal, permite pincelar el colorante directamente sobre el tejido para una mejor visualización al tiempo que se evita la tinción no controlada del EPR del agujero macular y de la retina periférica.



Para evitar el contacto del colorante con el EPR tras su paso por el agujero macular, se ha propuesto realizar la inyección lentamente, empleando dispositivos como VINCE, o colocando una burbuja de líquido sobre el agujero (perfluorocarbono líquido, sangre entera antóloga y hialuronato sódico). Se ha utilizado el perfluorocarbono líquido (PFCL) como agente protector del EPR en el agujero macular cuando se tiñe con ICG ya que son inmiscibles. Scupola et al han comunicado los resultados a 1 año protegiendo el EPR con PFCL, sin observar defectos a nivel del EPR y con una agudeza visual media final de 20/50; sin embargo, su empleo incrementa el costo de la cirugía y los tiempos quirúrgicos y es necesario aspirar completamente el PFCL para evitar la toxicidad retiniana. Lai et al tras el empleo de sangre autóloga para proteger el EPR de la ICG, observaron que se reducía el daño celular y que no se apreciaban diferencias entre los ojos tratados con sangre entera, plasma o concentrados de hematíes, sin que se apreciaran daños al tejido ni quedaran restos de ICG al cabo de 1 mes de seguimiento.





El azul brillante (BriB) conocido también como Azul Ácido o Coomassie, es un colorante aniónico del grupo del aminotriarilmetano con fórmula empírica C47H48N3S2O7Na y un peso molecular de 854 dalton. Se emplea como colorante alimenticio y se ha empleado fuera de indicación en la tinción de la cápsula y en vitrectomía y fue aprobado en la Unión Europea en 2007 como Brilliant peel (Fluoron/Geuder, Heidelberg, Alemania).







Bibliografía

MONTERO MORENO, R. M. (2010). OFTALMO.Sociedades oftalmológicas de España. Recuperado el 12 de mayo de 2016, de http://www.oftalmo.com/studium/studium2010/stud10-2/10b-04.htm

Azul Tripano

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN Y VIABILIDAD CELULAR

RESUMEN

Se determinó la concentración y viabilidad de una suspensión celular (linfoma de células B). El azul tripán tiñe a las células que presentan daño en la membrana plasmática, fue utilizado para diferenciar entre células viables y no viables / teñidas con azul tripán. Se preparó una disolución 1:2 con 10 μL del cultivo y azul de tripàn. Se usó la cámara de Neubauer para contar e inferir el número de células viables, como concentración celular, expresadas en células por mililitro. El volumen celular en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados contados. Se encontró a partir de las células (linfoma de células B) proporcionadas un 85.92 % de viabilidad y 580 0000 cel /mL de concentración celular.

INTRODUCCIÓN

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas dispersas en un fluido. Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de las células en la suspensión, así como el porcentaje de éstas que son viables. Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes técnicas, una de ellas es la cámara de contaje celular de la que existe numerosas variantes, entre ellas la cámara de Neubauer hasta equipos automáticos de contaje celular como el "Cell Coulter" de la empresa Beckman-Coulter.
La cámara de Neubauer o hemacitómetro (Figura 1), es utilizada generalmente para la cuenta de células sanguíneas como son los eritrocitos (glóbulos rojos) y linfocitos (glóbulos blancos), pero también puede ser utilizada para el conteo de otros tipos celulares. Las áreas grandes indicadas con los números 1, 2, 3 y 4 en la Figura 1 son utilizadas para contar los glóbulos blancos y el área con el número 5 es para contar los glóbulos rojos y plaquetas. Está cámara de contaje se adaptada al microscopio óptico. La cámara consta de un cubre objetos de cuarzo, con una depresión en el centro, y con una cuadricula marcada. Y con portaobjetos de un grosor mayor a los de uso común. En la parte superior del porta objetos se encuentran cuatro canales longitudinales y uno trasversal central. En la parte superior e inferior del canal trasversal están grabadas dos rejillas, las cuales están a su vez subdivididas.
El volumen celular en el cual se han contado las células resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número de cuadrados contados.1
Para determinar la viabilidad celular se emplean el método de tinción con azul tripán. El azul tripán es un colorante vital que se introduce en el interior de las células que presentan ruptura o daño en la membrana plasmática. Las células que aparecen en el microscopio, de color azul, son consideradas no viables.
Linfoma de células B .Grupo heterogéneo de tumores linfoides que generalmente expresan uno o más antígenos de células B o que representan la transformación maligna de linfocitos B del sistema inmunitario.2

MATERERIALES Y MÉTODOS

Equipo: Micropipeta de 100μL (Clinipett autoclavablel), micropipeta de 10μL, Cámara de Neubauer Bright light hemacytomether (Hausser scientific), Microscopio óptico (Leica).

Material: Puntas estériles para micropipeta (azul y amarilla), Tubos Eppendorf de 1.5 mL., Azul de Tripán (sigma T8154).

Procedimiento:

Preparación de la disolución 1:2. Se tomó 100µL del cultivo celular (linfoma de células B) y se colocó en un Eppendor. En otro Eppendor se agregó 10µL de azul tripán. Se homogenizó el cultivo con una micropipeta, y a partir del él se tomó 10µL, que fueron agregados al Eppendor en donde estaba contenido el azul tripán. Se prosiguió a homogenizar la mezcla azul tripán y cultivo nuevamente. Obteniendo así una dilución 1:2 del cultivo celular (factor dilución).
Montaje en la cámara de Neubauer. En la cámara de Neubauer se colocó el cubre objetos a lo largo. Con la punta de la micropipeta dispuesta en el canal, 10 μL de la suspensión de células y colorante se dejaron fluir por debajo del cubreobjetos en la cámara hasta que el área de la cuadrícula se llenó, evitando que se derramará o que entraran burbujas en el área de conteo. Figura 2.

Observación y conteo al microscopio. Una vez preparada la cámara Neubauer se colocó sobre la platina del microscopio óptico, dejándola unos minutos en reposo para que se sedimenten las células, sin dejar secar. Se observó y contó con el objetivo 10x en los cuadrantes 1, 2, 3, y 4. Una vez terminado el conteo se limpió la cámara de Neubauer.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS

El conteo de las células observadas en los cuadrantes 1, 2, 3 y 4 de la cámara de Neubauer se registró en la Tabla 1. Se observó células teñidas de azul / no viables (19) y células brillantes/ viables (116), de un total de 135 células contadas. En la figura 3 se observan las células (brillantes /viables y teñidas de azul/ no viables) en el cuadrante tres de la cámara de Neubauer. Se realizaron cálculos para determinar % de viabilidad y concentración celular de la muestra proporcionada (linfoma de células B), cuyo valor obtenido fue 85.92% y 580 0000 cel /mL, respectivamente.

DISCUSIONES

Factores como la homogenización de y /o de la muestra o azul tripán, re suspensión de la muestra, exactitud y presión de los volúmenes tomados por las micropipetas, y la destreza de la persona para contar las células pueden afectan los resultados, por lo que son muy importantes estos aspectos, para obtener resultados confiables. Se consideró que los factores anteriores fueron controlados adecuadamente dentro de lo posible (calibración dudosa de las micropipetas) pero lo resultados están dentro de un rango aceptable.

CONCLUSIONES

Mediante la tinción con azul tripán, fue posible la diferenciación entre células viables/ brillantes y teñidas de azul / no viables, y así determinar el porcentaje de viabilidad celular. Con la cámara de Neubauer fue posible inferir la concentración celular. Se encontró a partir de las células (linfoma de células B) proporcionadas un 85.92 % de viabilidad y 580 0000 cel /mL de concentración celular.

BIBLIOGRAFÍA

1. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. Gonzales de Buitrago J. 2004 Segunda edición. Ediciones Masson. Barcelona, España. Parte III, pag.278-279

2. Anatomía patológica. Steves A, Lowe J. 2001 segunda edición al español. Ediciones Harcourt, Madrid España. Capitulo 15, enfermedades de los ganglios linfáticos, Pag 310-311.